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公司新闻/正文
超速离心：高效构建拉沙病毒反向遗传学系统
158 人阅读发布时间：2025-02-06 13:35
不久前，中国科学院上海免疫与感染研究所钟劲研究组在 Emerging Microbes & Infections 上发表了一篇关于拉沙病毒（Lassa virus, LASV）的突破性研究论文，成功建立了一种新型的 BSL-2 拉沙病毒反向遗传学操作系统，为研究拉沙病毒的完整生命周期及抗病毒药物的筛选提供了重要工具。
拉沙病毒是一种高致病性病原体，能够引发严重的拉沙出血热，导致多系统损伤。由于其高致病性和高死亡率，美国疾控中心将其归类为 A 类生物恐怖病原。传统上，研究该病毒需要在生物安全四级（BSL-4）条件下进行。然而，BSL-4 实验室的稀缺性和高昂的成本限制了对拉沙病毒的研究和抗病毒药物的开发。
钟劲研究团队开发了一种新的 Lassa 病毒反向遗传学系统，利用在辅助细胞系中表达病毒蛋白并转染病毒最小基因组 RNA 的方法，在 BSL-2 条件下模拟了 LASV 的完整生命周期。
▲ 拉沙病毒新型反向遗传学系统示意图
团队首先在 Huh7 细胞系中稳定表达 LASV 的 NP、GP、Z 和 L 蛋白，形成辅助细胞系。然后，通过转染体外转录的 LASV 最小基因组 RNA（minigenome），成功产生了缺陷型病毒颗粒 LASVmg（仅保留病毒复制、转录和组装所需的非编码序列，在自然条件下不具备感染性）。
后续利用超速密度梯度离心法纯化 LASVmg，并分析其物理特性，评估了 LASVmg 在细胞中的复制和传播能力：
样品准备：
首先将 LASVmg 样品以 1,000 ×g 离心 5 分钟，以去除细胞碎片和细胞核
制备密度梯度液：
使用 Optiprep 碘克沙醇密度介质和 TNE 缓冲液（10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA），按比例混合，制备 0%, 15%, 25%, 40%, 60% 的碘克沙醇梯度
离心分离：
使用 CP80NX 超速离心机，150,000 ×g，离心 5 小时
收集馏分：
从上到下收集 12 个馏分，每份 320 μl
回收：
用滴定法测定各馏分的感染滴度百分比，回收占比最高的第 5 馏分（≈50%），馏分密度为 1.07 g/mL
在这篇论文中，CP80NX 超速离心机在实验中发挥了关键作用，通过密度梯度离心技术可以成功分离和纯化 Lassa 缺陷型病毒颗粒（LASVmg），为后续的病毒特性分析和抗病毒研究提供了重要的基础。
▲ CP80NX：80,000rpm（615,000 × g）
此外，研究人员还利用 CRISPRi 技术敲低细胞中的 α-DG 和 LAMP1，揭示了 LAMP1 在 LASVmg 感染中的关键作用，其是拉沙病毒侵入细胞必需的胞内受体，而有悖于之前的报道，胞外受体 α-DG 对于病毒的侵入却不是必需的。同时，该研究还证实了干扰素 -α 和利巴韦林的抗 LASV 作用，并揭示了利巴韦林的抗病毒作用机制。
总的来讲，钟劲研究团队设计的新型反向遗传学系统为科研人员在 BSL-2 实验室内开展拉沙病毒生命周期的研究以及抗病毒药物的筛选提供了重要的研究工具。