mRNA研发的基石！质粒高效分离方案

1. 细菌培养：

将细菌接种后在 37℃ 培养箱中培养 24 小时，挑取单克隆菌落，在摇床（Innova^® S44i 摇床）中扩增并甘油冻存。在 250 mL 培养瓶中预培养，之后再扩增到 2.5 L 培养瓶中培养,并对细菌进行沉淀离心（CR22N 高速落地离心机和 R9A2 转子 4℃，3,340 xg 离心 30 分钟），将细菌沉淀物重悬用于 DNA 纯化。

2. 质粒纯化：

用 25 mL 缓冲液 P1 重悬沉淀物，并将其分配到 5 x 50 TC 离心管中。加入缓冲液 P2（5 ml）孵育3分钟，然后加入缓冲液 P3（5 ml）。使用 R15A 转子，4°C，20,000 xg 离心 30 分钟。

将缓冲液 PE（700 uL）加入柱膜中进行洗涤,并使用 R22A4 转子在 4℃，20,000 xg 下将离心柱离心两次,每次 1 分钟。之后在 4℃，20,000 xg 下将离心柱离心两次（1 min），并用 200 μL 水洗脱 DNA。

3. 质粒线性化和纯化：

将含有质粒（500 ng/uL）、5 uL 缓冲液（100x）、0.5 μL BSA（10x）、Spel（0.1 U/uL）和水的 50 uL 单个限制酶切消化物在混匀仪（Eppendorf ThermoMixer^® C）中，37℃，培养 2 小时。然后,在80℃，灭活 20 分钟。

将混合物转移到离心柱中， R22A4 转子进行离心（4℃，17,900 xg，1min）。用 0.75 mL PE 缓冲液洗涤 DNA，再次离心（4℃，17,900 x g，1 min）。最后，用 50 μL 水在 4℃，17,900 xg，洗脱 1 分钟。

4. 通过聚合酶链式反应（PCR）添加 poly-（A）尾

设计引物后通过在 PCR 进行扩增，可以使用 poly（A）聚合酶为 mRNA 添加 poly-（A）尾。并将样品储存在 -20℃ 下，用于进一步分析。

5. 体外转录：

使用纯化加尾 PCR 产物作为反应模板，将定制的核糖核苷混合物涡旋并短暂离心。将溶液在 PCR仪 （MasterCycler@ X50 Aluminum）中，37°C 下孵育 4 小时。培养后,向样品中加入 2 uL Turbo DNase，并在 37°C 下孵育 15 分钟，纯化 RNA。

6. 电泳

使用琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳来分离和检测 mRNA，评估 mRNA 的纯度和完整性。