组会变成狼人杀！大师姐的 qPCR 出错，罪魁祸首是谁？

1. 准备阶段：

耗材：枪头、镊子、枪头盒、PCR 管均采用高温消毒灭菌的方式处理。EP 管需要保持无酶，可预先在超净台取出放置，减少与外界空气接触。

试剂：DEPC 水用于配置 RNA 相关试剂，注意其特殊处理要求；PCR 反应体系中各组分多为直接购买的无菌试剂，按需直接使用。

实验室管理：实施严格的分区管理，定期紫外线与消毒剂消毒台面；离心机预冷；实验人员需穿戴防护装备，遵守操作规程，控制人员流动。

污染防控：设置对照以监控实验过程中可能的污染情况。

2. RNA 提取阶段：

RNA 沉淀：将上层 RNA水相溶液取尽（缓慢转移），每 1 mL Trizol 试剂加 0.5 mL 异丙醇，室温静置 10 min（不要吸到下面中间层，宁缺毋滥）。4℃ 孵育后离心 10 min。EP 管底部的白色沉淀即为总 RNA 沉淀，弃去上清（先粗吸，后细吸，可以大枪头套小枪头）。

RNA 洗涤：用 75% 乙醇（用 DEPC 水，现配现用）重悬沉淀，采用瞬时漩涡震荡 10 余次，离心后弃上清。可再离心 1min 将挂壁乙醇甩到管底，吸干剩余乙醇，将 RNA 沉淀在空气中干燥 5～10 min（需保持 RNAfree 的环境，可倒扣在吸水纸上，开盖空气干燥）。

RNA 溶解：用 20～50 μL 不含 RNase 的水充分溶解沉淀，取部分检测RNA质量。

tips

1.若 RNA 沉淀量很少，可在 EP 管外标记位置后进行室温晾干。

2.若 RNA 沉淀量很少，可以晾 3~5min；若沉淀量较多，可以晾 5~10min。

3.晾干后可用吸水纸擦拭管口未干的液滴。

3. 样本存储阶段：

将 RNA 置于 -80℃ 冰箱保存，如需长期稳定保存，可加入 RNA 稳定剂，并定期监测 RNA 完整性。

4. 逆转录阶段：

反应条件优化：基于 RNA 质量调整逆转录参数，重点关注退火温度设置，确保引物与 mRNA 模板的特异性结合。

时间调整：灵活设定逆转录反应时间，既要保障 cDNA 的完整合成，也要避免非特异性产物积累。

效果验证：利用定性 PCR 检验逆转录效率和 cDNA 质量，作为优化逆转录条件的依据。

5. qPCR 扩增阶段：

设定适宜的 PCR 循环参数以确保有效变性、特异退火和充分延伸，同时选用特异性强、灵敏度高的引物，并搭配验证过的定量 PCR 试剂盒进行实验。