实习师妹有点可爱（笨拙），分离淋巴细胞竟出这种岔子

又是一年实习季，实验室里出「奇迹」，我碰上了一位「十万个为什么」师妹：

师妹：师兄，导师让我分离一例病患血液中的淋巴细胞，是罕见的淋巴系恶性增生性疾病， Percoll 和 Ficoll 怎么选呀？Ficoll 分离人外周血中淋巴细胞，血液样品和 Ficoll 的比例这么设置可以吗？离心出来这么多层，白膜层在哪里？
 

（C 位师兄的实验结果 VS Emo 师妹的实验结果）

师兄，为什么全是浑浊的，看不到白膜层呢？为什么全程按照 protocol，但分出来的淋巴细胞很少，根本不够后面的实验用？

......

师兄： 你这样的人（ben）才（dan）到底怎么考上医学院的？

           来，我一次给你讲清楚......（师兄内心 OS：看你拿着样本这么发愁，终究还是心软了）

 

人淋巴细胞的普遍来源是外周血，分离目标是：收率越高越好，纯度越高较好，活性越高越好。要达到这个要求，整个实验过程要手稳、温度稳、设备稳，缺一不可。

根据血液中细胞量的不同（红细胞和粒细胞的密度大约1.090 g/mL；淋巴细胞和单核细胞密度在 1.075～1.090 g/mL；血小板的密度在 1.030～1.035 g/mL)，一般会采用离心手段从人外周血或脐带血中分离淋巴细胞。

实验室分离淋巴细胞的实验步骤

淋巴细胞分离步骤

1. 实验开始前先启动离心机预冷功能，设置预冷温度为 20°。将离心机升降速调整为缓慢降速. 防止停止过程过快造成分层样品的重悬，分层不清晰。切记！

2. 血液要新鲜，2 个小时以内分离最好，抗凝全血要用等体积的 PBS 稀释。稀释后的血液缓慢平铺到等体积的 Ficoll 分离液上方，注意保持两液面界面清晰。

3. 将铺设好样品的离心管放置于离心机中，中心对称放置。设定离心条件：温度 20℃，相对离心力 400 x g，离心时间 30 min。

4. 离心后将出现明显的分层：上层是稀释的血浆层，中间是透明的分离液层，血浆与分离液之间的白膜层即为淋巴细胞层，离心管底部是红细胞与粒细胞（如下图）。

5. 小心的吸取白膜层细胞到离心管中，10 mL PBS 洗涤白膜层细胞，温度 20℃，相对离心力 400 x g，10 min。 

6. 弃上清，5 mL 的 PBS 重悬细胞，温度 20℃，相对离心力 400 x g，10 min。

重复「step 6」1 次，弃上清，细胞重悬备用。

 

师妹：这就结束了吗？

师兄：No Way！一些血小板和单核细胞可能会与淋巴细胞集中于一层，若有必要进一步分离纯化，可用 MACS（磁珠活化细胞分选）或 FACS（荧光激活细胞分选）等方法，以特异的淋巴细胞亚群为指标，进行正交筛选。

师妹：这也太复杂了，今天的晚饭又变成宵夜了？

师兄：你今天走运，实验室刚采购了一台新的离心机，一键式离心条件设置，温度控制特别精准，据说还可以省去缓慢降速时的等待时间，降速从 0 档调到 3 档，整个 PBMC 分离实验时间直降 > 50%！

师妹：真方便，这可大大节约了我们科研民工的时间啊～简直是心巴上的离心机。

新离心机很宝贝的，操作要点我还是要再唠叨一下，马虎不得。

师兄：为了更大程度节约科研人的时间和提高分离细胞的效率，Eppendorf 提供一站式离心解决方案，从主机选型，到转子、适配器、离心耗材以及服务选择，一键开启，轻松离心。今天为大家介绍一款高效分离 PBMC 的冷冻离心机套装，还有「小师妹」的实验结果支持：采用 5910 Ri 多功能台式冷冻离心机的快速分离 PBMC 检测样品（实验方案）

5910 Ri 智能台式多功能冷冻离心机 PBMC 分离套装：

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（编程功能：独特的参数保存，调用超快，参数一致时再也无惧重复实验）

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高度通用的 Eppendorf 5910 Ri 冷冻离心机 10 种不同离心转子，适配多种类型离心管，如检验科常见的采尿管、各规格采血管、15/50 mL 离心管、175～1000 mL 离心瓶等，完美适配科研人的多种场景需求~